Far-western blot
O far-western blot (ou far-western blotting) é un método de bioloxía molecular que está baseado na técnica do western blot que se utiliza para detectar interaccións proteína-proteína in vitro.[1][2]. Mentres que o western blot normal usa un anticorpo para detectar a proteína de interese, o far-western blot usa unha proteína que non é un anticorpo, que se pode unir á proteína de interese. Así, o western blot utilízase para a detección de certas proteínas, o far-western blot emprégase para detectar interaccións proteína-proteína.
Método
[editar | editar a fonte]No western blot tradicional utilízase unha electroforese en xel para separar proteínas da mostra; estas proteínas son despois transferidas a unha membrana nun paso de transferencia (blotting). No western blot, identifícanse proteínas específicas utilizando unha sonda de anticorpo.
O far-western blot emprega proteínas que non son anticorpos como sondas que se unen ás proteínas de interese no blot. Desta maneira, poden identificarse só as proteínas do blot con capacidade de unirse á sonda. A proteína que se utiliza como sonda é a miúdo producida en E. coli utilizando un vector de clonación de expresión (crea unha biblioteca de clons). As proteínas dos lisados da célula que conteñen as proteínas a detectar (que podemos chamar proteínas "diana" ou "presa") son separadas primeiramente con SDS-PAGE ou PAGE nativa, e transferidas a unha membrana, igual que nun western blot estándar. Despois, as proteínas na membrana son desnaturalizadas e renaturalizadas. As membranas son despois bloqueadas e sondadas, xeralmente con proteínas sonda purificadas (que podemos chamar proteínas "isco"). Estas proteínas sonda son detectadas en puntos da membrana onde se uniron á proteína diana cando forman un complexo coa proteína diana.[3]
A proteína sonda pode despois visualizarse por medio dos métodos usuais. Pode ser marcada radioactivamente; pode ter unha etiqueta de afinidade específica como unha His ou unha etiqueta FLAG para as cales existen anticorpos que as poden detectar; ou pode haber un anticorpo específico para a proteína que fai de sonda (non para a proteína diana coma no western blot).
Como os extractos de células son xeralmente desnaturalizados ao fervelas con deterxente antes de facer a electroforese en xel, esta estratexia é máis útil para detectar interaccións que non requiran o pregamento da estrutura nativa da proteína de interese.
Notas
[editar | editar a fonte]- ↑ Catherine S. Chan, Tara M. L. Winstone, Raymond J. Turner: Investigating protein-protein interactions by far-Westerns. In: Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. Bd. 110, 2008, ISSN 0724-6145, S. 195–214, PMID 18219468, doi:10.1007/10_2007_090.
- ↑ Hochspringen ↑ Randy A. Hall: Studying protein-protein interactions via blot overlay or Far Western blot. In: Methods in Molecular Biology. Bd. 261, 2004, ISSN 1064-3745, S. 167–174, PMID 15064457, doi:10.1385/1-59259-762-9:167
- ↑ Life technologies Overview at piercenet.com Studying Protein-Protein Interactions by Far-Western Blotting
Véxase tamén
[editar | editar a fonte]Bibliografía
[editar | editar a fonte]- Erica A. Golemis, Peter D. Adams: Protein-protein interactions. A molecular cloning manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2005, ISBN 0-87969-723-7.
Outros artigos
[editar | editar a fonte]Ligazóns externas
[editar | editar a fonte]- Far-Western Blotting Medical Subject Headings (MeSH) na Biblioteca Nacional de Medicina dos EUA.
