Inmunohistoquímica

Preparación de cerebro de rato tinguido inmunohistoquimicamente.

A inmunohistoquímica (IHQ ou IHC, polas súas siglas en inglés) é a técnica que obtén selectivamente imaxes de antíxenos proteicos das células dunha sección dun tecido utilizando anticorpos que se unen especificamente aos antíxenos de tecidos biolóxicos. A inmunohistoquímica recibe este nome das raíces "immuno", que fan referencia aos anticorpos usados no procedemento, e "histo," que significa tecido (compárese con inmunocitoquímica, que se aplica a células). Albert Coons foi quen primeiro conceptualizou o procedemento en 1941.

A tinguidura inmunohistoquímica utilízase amplamente no diagnóstico de células anormais como as que se encontran en tumores canceríxenos. Os marcadores moleculares específicos son característicos de estados ou eventos celulares particulares como a proliferación ou morte celular (apoptose). A inmunohistoquímica utilízase moito tamén en investigación básica para comprender a distribución e localización de biomarcadores e proteínas expresadas diferencialmente en distintas partes dun tecido biolóxico.

A visualización da interacción anticorpo-antíxeno pode realizarse de varias maneiras. No caso máis común, un anticorpo é conxugado cun encima, como a peroxidase, que pode catalizar unha reacción produtora de cor (ver tinguidura con inmunoperoxidase). Alternativamente o anticorpo pode tamén ser etiquetado cun fluoróforo, como a fluoresceína ou a rodamina (ver inmunofluorescencia).

Preparación da mostra

A preparación da mostra é esencial para manter a morfoloxía da célula, a arquitectura dos tecidos e a antixenicidade dos epítopos diana. Isto require unha axeitada recollida dos tecidos, fixación e corte. Adoita utilizarse unha solución de paraformaldehido para fixar o tecido, pero tamén se usan outros métodos.

Preparacións histolóxicas

O tecido despois pode ser cortado en finas seccións ou usado enteiro, dependendo do propósito do experimento ou do propio tecido. Antes de cortalo, a mostra do tecido pode ser incrustada nun medio, como a cera de parafina ou criomedios. As seccións poden ser cortadas en finas láminas con diversos instrumentos, como micrótomos, criostatos ou vibrátomo. As seccións móntanse despois no portaobxectos, son deshidratadas con lavados con alcohol de diferentes concentracións (por exemplo do 50%, 75%, 90%, 95% e 100%), e eliminados usando un deterxente como o xileno antes de ser vistos ao microscopio.

Dependendo dos métodos de fixación e preservación de tecidos, a mostra pode necesitar pasos adicionais para facer que os epítopos queden dispoñibles para a súan unión ao anticorpo, como a desparafinación e a recuperación do antíxeno. Para tecidos incrustados en parafina fixados con formol, a recuperación do antíxeno é xeralmente necesaria e implica o pretratamento das seccións con calor ou proteases. Estes pasos poden establecer unha diferenza entre a tinguidura ou non dos antíxenos diana.

Redución da inmunotinguidura non específica

Dependendo do tipo de tecido e o método de detección do antíxeno, pode ser necesario que a biotina ou encimas endóxenos sexan bloqueados ou temperados (quench), respectivamente, antes da tinguidura polo anticorpo. Aínda que os anticorpos mostran avidez preferencial por epítopos específicos, poden unirse parcialmente ou debilmente a sitios de proteínas non específicas (tamén chamados sitios reactivos) que son similares aos sitios de unión semellantes dos antíxenos diana. Unha gran cantidade de unións non específicas causa unha alta tinguidura de fondo, que enmascararía a detección do antíxeno diana. Para reducir esta tinguidura de fondo en hinmunohistoquímica, inmunocitoquímica e outros métodos de inmunotinguidura, as mostras son incubadas cun tampón que bloquea os sitios reactivos aos cales se poderían unir os anticorpos primarios e secundarios. Entre os tampóns comúns bloqueantes están o soro normal, leite en po desnatado, seroalbumina bovina (BSA) ou xelatina. Disponse de tampóns bloqueantes comerciais con formulacións de marca rexistrada para unha maior eficiencia. Entre os métodos para eliminar a tinguidura de fondo están a dilución dos anticorpos primario ou secundario, cambiar o tempo ou a temperatura de incubación, e usar un sistema de detección diferente ou un anticorpo primario diferente. O control de calidade debería como mínimo incluír un tecido que funcione como control positivo que se saiba que expresa o antíxeno e controis negativos de tecidos que se saiba que non expresan o antíxeno, así como o mesmo tecido comprobado da mesma maneira con omisión do anticorpo primario (ou mellor, a absorción do anticorpo primario).

Etiquetado de mostras

Tipos de anticorpos utilizados

Os anticorpos utilizados para a deteción específica poden ser policlonais ou monoclonais. Os anticorpos policlonais son producidos por animais que foron inxectados coa proteína de interese, ou un fragmento de péptido e, despois de que se estimula unha resposta secundaria, hai que illar os anticorpos do soro completo. Así, os anticorpos policlonais son unha mestura heteroxénea de anticorpos que recoñecen varios epítopos. Os anticorpos monoclonais prodúcense inxectando un animal co antíxeno e tomando unha mostra do seu tecido inmune, illando as células B do animal, e inmortalizándoas ao fusionalas con células cancerosas de mieloma, que producen anticorpos que mostran especificidade para un só epítopo.

Nos métodos de detección inmunohistoquímicas, os anticorpos son clasificados como reactivos primarios e secundarios. Os anticorpos primarios son específicos para o antíxeno de interese e normalmente non están conxugados (non están etiquetados), mentres que os anticorpos secundarios son específicos contra os propios anticorpos primarios. O anticorpo secundario está normalmentre conxugado a unha molécula enlazadora como a biotina, que despois recruta as moléculas reporteiras (que dan cor), ou ben o anticorpo secundario únese directamente á molécula reporteira.

Moléculas reporteiras inmunohistoquímicas

As moléculas reporteiras varían baseándose na natureza dos métodos de detección, dos cales os máis usados son os cromoxénicos e a detección fluorescente mediada por un encima ou un fluoróforo, respectivamente. Con reporteiros cromoxénicos, unha etiqueta encimática reacciona cun substrato para render un produto intensamente coloreado que pode ser analizado cun microscopio óptico ordinario. Aínda que a lista de substratos de encimas é ampla, a fosfatase alcalina e a peroxidase do ravo picante son os dous encimas máis usados como etiquetas para a detección de proteínas. Existen matrices de substratos cromoxénicos, fluoroxénicos e quimiolminescentes para o uso con cada encima, como a DAB ou BCIP/NBT, que producen unha tinguidura castaña ou púrpura, respectivamente, cando os encimas están unidos.

A reacción con DAB pode ser potenciada usando níquel, producindo unha tinguidura púrpura/negra intensa. Os reporteiros fluorescentes son pequenas moléculas orgánicas usadas para a detección inmunohistoquímica e tradicionalment inclúen a FITC, TRITC e AMCA, e derivados comerciais como os Alexa Fluors e Dylight Fluors, que mostran unha mellora similar do rendemento pero varían en prezo. Para os métodos de detección cromoxénicos e fluorescentes, a análise densitométrica do sinal pode proporcionar datos semi ou completamente cuantitativos, respectivamente, para correlacionar o nivel do sinal reporteiro ao nivel da expresión ou localización de proteínas.

O método directo de tinguidura inmnohistoquímica usa un anticorpo etiquetado, que se une directamente ao antíxeno que está sendo tinguido.

O método indirecto de tinguidura inmunohistoquímica usa un anticorpo contra o antíxeno que se está a probar, e un segundo anticorpo, etiquetado, contra o primeiro.

Métodos de detección de antíxenos diana

O método directo é un método de tinguidura nunha soa etapa e implica o uso dun anticorpo etiquetado (por exemplo, antisoro conxugado con FITC) que reacciona directamente co antíxeno en seccións de tecidos. Aínda que esta técnica utiliza só un anticorpo e, por tanto, é simple e rápida, a sensibilidade é menor debido á pequena amplificación do sinal, a diferenza dos métodos indirectos. Porén, esta estratexia é utilizada menos frecuentemente que a súa alternativa multifase.

O método indirecto implica usar un anticorpo primario non etiquetado (primeira capa) que se une ao antíxeno diana no tecido, e un anticorpo secundario etiquetado que reacciona co anticorpo primario. Como se mencionou máis arriba, o anticorpo secundario debe ir dirixido contra a IgG da especie animal na cal o anticorpo primario se produciu. Este método é máis sensible que as estratexias de detección directa a causa da amplificació do sinal debida á unión de varios anticorpos secundarios a cada anticorpo primario se o anticorpo secundario é conxugado a un reporteiro fluorescente ou encimático.

Pode conseguirse unha maior amplificación se o anticorpo secundario é conxugado a varias moléculas de biotina, que poden recrutar complexos de encima unido a avidina, estreptavidina ou proteína NeutrAvidin. A diferenza entre estas tres proteínas unidas a biotina é a súa afinidade de unión individual para dianas de tecido endóxenas o que orixina a unión non específica e unha alta tinguidura de fondo; a orde destas proteínas segundo as súas afinidades de unión non específicas, de maior a menor, é: 1) avidina, 2) estreptavidina e 3) proteína NeutrAvidin.

O método indirecto, ademais da súa gran sensibilidade, tamén ten a vantaxe de que só cómpre xerar un número relativamente pequeno de anticorpos secundaios (etiquetados) conxugados estándar. Por exemplo, un anticorpo secundario contra IgG de coello, que se pode comprar no mercado, é útil cun anticorpo primario producido en coellos. Co método directo, sería necesario etiquetar cada anticorpo primario para cada antíxeno de interese.

Contratinguidura

Despois da tinguidura inmunohistoquímica do antíxeno diana, a miúdo aplícase unha segunda tinguidura (contratinguidura) para proporcionar contraste que axuda a salientar a tinguidura primaria. Moitas destas tinguiduras mostran especificidade para clases específicas de biomoléculas, mentres que outras tinguirán toda a célula. Disponse de tinguiduras cromoxénicas e fluorescentes para inmunohistoquímica que proporcionan un amplo conxunto de reactivos axeitados para cada deseño experimental, entre os que están: a hematoxilina, a tinguidura Hoechst e a DAPI.

Solución de problemas

Nas técnicas inmunohistoquímicas, hai varios pasos que seguir antes da tinguidura final do antíxeno dos tecidos, que poden causar diversos problemas como unha forte tinguidura de fondo, a tinguidura feble do antíxeno diana e a autofluorescencia. A reactividade cruzada dos anticorpos primario/secundario, a biotina endóxena ou os encimas reporteiros son causas comúns dunha forte tinguidura de fondo, mentres que a tinguidura débil pode ser causada por unha escasa reactividade encimática ou pouca potencia do anticorpo primario. Ademais, a autofluorescencia pode deberse á natureza do tecido ou ao método de fixación. Estes aspectos da preparación da inmunohistoquimica e da tinguidura de anticorpos deben ser atendidos sistematicamente para identificar e superar os problemas na tinguidura.

Marcadores inmunohistoquímicos diagnósticos

Tingidura inmunohistoquímica de ril normal con CD10.

A inmunohistoqímica é unha excelente técnica de detección e ten a tremenda vantaxe de poder mostrar exactamemente onde se localiza unha determinada proteína dentro do tecido examinado. Tamén é un método efectivo para examinar os tecidos. Isto fai que sexa unha técnica moi utilizada en neurociencias, que permite examinar a expresión de proteínas en estruturas específicas do cerebro. A súa maior desvantaxe é que, a diferenza das técnicas de inmunoblotting, nas que a tinguidura se comproba cunha escala de pesos moleculares, é imposible mostrar en inmunohistoquimica que a tinguidura se corresponde coa proteína de interese. Por esta razón, os anticorpos primarios deben ser ben validados nunha western blot ou procedemento similar. A técnica é incluso máis utilizada en patoloxía cirúrxica diagnóstica para a inmunofenotipificación de tumores; por exemplo, a inmunotinguidura para E-cadherina para diferenciar entre o carcinoma ductal in situ (tinguidura positiva) e o carcinoma lobular in situ (sen tinguidura positiva)). Máis recentemente, as técnicas inmunohistoquímicas foron útiles na diagnose diferencial de múltiples formas de carcinomas de glándula salivar, e cabeza e pescozo.

A diversidade de marcadores inmunohistoquímicos usados en patoloxía cirúrxica diagnóstica é grande. Moitos laboratorios clínicos en hospitais terciarios teñen menús duns 200 anticorpos usados para diagnóstico, prognóstico e biomarcadores preditivos. Exemplos dalgúns marcadores comunmente usados son:

• BrdU: usada para identificar células. Usada para identificar tumores e en investigacións de neurociencia.
• Citoqueratinas: usadas para a identificación de carcinomas, pero poden tamén ser expresadas nalgúns sarcomas.
• CD15 e CD30: usados para a enfermidade de Hodgkin.
• Alfa fetoproteína: para os tumores de sacovitelino e carcinoma hepatocelular.
• CD117 (KIT): para os tumores estromais gastrointestinais e tumores de mastocito .
• CD10 (CALLA): para carcinoma de célula renal e leucemia linfoblástica aguda.
• Antíxeno prostático específico (PSA): para o cancro de próstata.
• A tinguidura de receptores de estróxenos e proxesterona (ER & PR) utilízase tanto para o dignóstico (tumores de mama e xinecolóxicos) e para o prognóstico do cancro de mama e na predición da resposta á terapia (receptor de estróxenos).
• Identificación de linfomas de célula B usando CD20.
• Identificación de linfomas de célula T usando CD3.

Terapia dirixida

No cancro son alteradas diversas vías moleculares e algunhas das alteracións poden ser a diana da terapia do cancro. A inmunohistoquímica pode utilizarse para avaliar aqueles tumores que é probable que respondan á terapia, ao detectarse a presenza ou niveis elevados da diana molecular.

Inhibidores químicos

A bioloxía dos tumores permitiu descubrir diversas dianas intracelulares potenciais. Moitos tumores son dependentes de hormonas. A presenza de receptores de hormonas pode utilizarse para determnar se un tumor pode responder potencialmente á terapia hormonal. Unha das primeiras terapias foi a administración do axente antiestroxénico tamoxifeno, usado para tratar o cacnro de mama. Estes receptores de hormonas poden ser detectados por inmunohistoquímica. Imatinib, un inhibidor intracelular da tirosina quinase, desenvolveuse para tratar a leucemia mielóxena crónica, unha doenza caracterizada pola formación dunha tirosina quinase anormal específica. Imitanib demostrou ser efectivo en tumores que expresan outras tirosina quinases, especialmente KIT. A maioría dos tumores estromais gastrointestinais expresan KIT, que pode ser detectada por inmmunohistoquímica.

Anticorpo monoclonal

Por inmunohistoquímica demóstrase que moitas proteínas están moi reguladas á alza en estados patolóxicos, e estas son dianas potenciais para as terapias que utilizan anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais, debido ao seu tamaño, son utilizados contra dianas da superficie celular. Entre as dianas sobreexpresadas están membros da familia do receptor do factor de crecemento epidérmico (EGFR), proteínas transmembrana cun dominio receptor extracelular que regula unha tirosina quinase intracelular. Destes, HER2/neu (tamén chamado Erb-B2) foi o primeiro que se desenvolveu. A molécula exprésase fortemente en vaios tipos de células cancerosas, moi notablemente no cancro de mama. Os anticorpos contra HER2/neu foron aprobados pola FDA para o tratamento clínico do cancro co nome de fármaco Herceptin. Hai tamén probas inmunohistoquímicas dispoñibles comercialmente, como Dako HercepTest, Leica Biosystems Oracle e Ventana Pathway.

De xeito similar, EGFR (HER-1) é sobreexpresado en diversos cancros como o de cabeza e pescozo e o de colon. A inmunohistoquímica utilízase para determinar os pacientes que se poden beneficiar de anticorpos terapéuticos como Erbitux (cetuximab). Un sistema comercial para detectar o EGFR por inmunohistoquímica son o Dako pharmDx.

Mapado da expresión proteica

A inmunohistoquímica pode tamén utilizarse para facer un perfil máis xeral das proteínas, sempre que se dispoña de anticorpos validados para inmunohistoquímica. O Atlas das Proteínas Humanas mostra un mapa de expresión de proteínas en órganos humanos normais e tecidos. A combinación de inmunohistoquímica e micromatrices de tecidos proporciona os padróns de expresión proteica nun gran número de tipos de tecidos. A inmunohistoquímica tamén se usa para facer un perfil de proteínas nas formas máis comúns de cancro humano.

Véxase tamén

Outros artigos

• Hibridación in situ cromoxénica

Ligazóns externas

• The Human Protein Atlas
• Ramos-Vara JA, Miller MA (2014). "When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry--the red, brown, and blue technique.". Veterinary Pathology 51 (1): 42–87. PMID 24129895. doi:10.1177/0300985813505879. 
• Overview of Immunohistochemistry--describes all aspects of IHC including sample prep, staining and troubleshooting
• Immunofluorescent Staining of Paraffin-Embedded Tissue (IF-P)
• IHC Tip 1: Antigen retrieval - should I do PIER or HIER? Arquivado 23 de abril de 2016 en Wayback Machine.
• Histochemical Staining Methods - University of Rochester Department of Pathology
• Immunohistochemistry Staining Protocol Arquivado 15 de outubro de 2007 en Wayback Machine.
• Burnett R, Guichard Y, Barale E (1997). "Immunohistochemistry for light microscopy in safety evaluation of therapeutic agents: an overview". Toxicology 119 (1): 83–93. PMID 9129199. doi:10.1016/S0300-483X(96)03600-1. 
• Immunohistochemistry Medical Subject Headings (MeSH) na Biblioteca Nacional de Medicina dos EUA.
• Joyner, A.; Wall, N. (2008). "Immunohistochemistry of Whole-Mount Mouse Embryos". Cold Spring Harbor Protocols 2008 (2): pdb.prot4820. doi:10.1101/pdb.prot4820.